1965 yılının 14 Mart'ını 15 Mart'a bağlayan gece boyunca yaptıkları toplantı sonucunda Guevara ve Castro, Sahara Çölü altındaki bölgede Küba'nın ilk askerî operasyonunu bizzat Guevara'nın yönetmesi konusunda anlaştılar.

Bazı güvenilir kaynaklar Guevara'nın kendisini bu operasyonda desteklemesi için Castro'yu ikna ettiğini söyler. Aynı derecede güvenilir diğer kaynaklar ise Latin Amerika ülkelerindeki koşulların focos gerilla çekirdeklerinin kurulması için henüz uygun olamdığını savunan Castro'nun bu eyleme girmesi için Guevara'yı ikna ettiğini söyler. Castro'nun kendisi de ikinci görüşün doğru olduğunu söylemiştir.

O zamanlar Cezayir'in devlet başkanı olan ve Guevara ile kısa süre önce görüşen Ahmed Bin Bella ise şöyle demiştir: "Afrika'da hüküm süren durumun büyük devrim potansiyeline sahip görünmesi, Che'yi Afrika'nın emperyalizmin zayıf halkası olduğu sonucuna itti. O da artık çabalarını Afrika'ya yönlendirmeye karar verdi." 

Küba operasyonu Kongo-Kinşasa'daki (önceleri Belçika Kongosu, sonradan Zaire ve günümüzde Kongo Demokratik Cumhuriyeti) Patrice Lumumba yanlısı Marksist Simba hareketinin desteklenmesi ile sürdürülecekti. Guevara, yardımcısı Victor Dreke ve on iki Kübalı 24 Nisan 1965'te Küba'ya vardı. Diğer Kübalılar da kısa süre sonra onlara katıldılar. 

Bir süre, gerilla lideri Laurent-Désiré Kabila ile çalıştılar. Kabila, aynı yılın Kasım ayında Kongo ordusu tarafından bastırılan bir isyana girişmeleri için Lumumba'nın destekçilerine yardım etmişti. Guevara, önemsiz biri olduğuna karar verdiği Kabila'yı bırakmış ve şöyle yazmıştır: "Hiçbir şey onun bu ânın gerektirdiği adam olduğuna beni inandıramaz."

Guevara, 37 yaşında olmasına ve resmî askerî eğitim almamış olmasına rağmen, Batista'nın devrilmesinde önemli yer işgal eden Santa Clara harekâtının da içinde bulunduğu Küba devrimi deneyimlerine sahipti. Astımı nedeniyle Arjantin'de askere alınmamıştı. Perón hükümetine olan muhalefeti gözönüne alındığında bundan gurur duyardı.

Mike Hoare'un içinde bulunduğu Güney Afrikalı paralı askerler ve Kübalı sürgünler Kongo ordusuyla birlikte Guevara'yı engellemeye çalıştılar. Guevara'nın haberleşmesini dinliyor, saldırmak için hazırlanan isyancılara ve Kübalılara pusu kuruyor ve Guevara'nın ikmal hatlarını kesiyorlardı. Guevara'nın amacı yerel Simba savaşçılarına komünist ideolojiyi ve gerilla savaşını öğreterek bir anlama Küba Devrimini 'ihraç etmekti'. Guevara Pasajes de la Guerra Revolucionaria: Congo (Kongo Günlükleri)'nde devrimin başarısızlığının ana nedenleri olarak yerli Kongo kuvvetlerinin yeteneksizliği, uzlaşmazlığı ve kendi aralarındaki sürtüşmeyi göstermiştir.

Aynı yılın sonlarına doğru astımı nüksetmiş, yedi ay sıkıntı yaşadıktan sonra düş kırıklığına uğramış bir şekilde, Küba'dan gelenlerden sağ kalanlarla (birliğinin altı üyesi ölmüştü) Kongo'yu terketti. Bir noktada yaralıları Küba'ya gönderip, tek başına savaşmaya devam etmeyi ve devrimcilere örnek teşkil etmeyi de düşünmüştü. Ancak silah arkadaşları ve Castro'nun gönderdiği iki memurun ikna etmesi sonucu Kongo'dan ayrılmayı kabul etti.

Ölümünden sonra açıklanması niyetiyle bıraktığı mektubun Castro tarafından kamuoyuna açıklanması ve bu mektupta dünyanın diğer bölgelerindeki devrimlere kendini adamak için Küba ile olan tüm bağlantılarını kopardığını yazması, ahlakî açıdan diğer savaşçılarla Küba'ya dönmesini engellemiştir. Kongo'dan ayrıldıktan sonra altı ay boyunca Dar-üs-Selam, Prag ve Alman Demokratik Cumhuriyeti'nde saklanmış, Kongo deneyiminde yazdığı anılarını toparlamış ve biri felsefe diğeri ekonomi üzerine iki kitabın taslaklarını yazmıştır.

Bu dönem boyunca Castro, Guevara'yı Küba'ya dönmesi için zorladı, Guevara bunu kabul ettiğinde dönüşünün geçici olacağı ve adadaki varlığının sır kalacağı şartını koştu; Latin Amerika'da bir yerlerde yeni bir devrim çabasına hazırlık yapmak için gereken birkaç aylık bir süre için geri dönecekti.