Eylül 1954'te Meksika'ya gelişinden kısa süre sonra, Guevara Nico López ve Guatemala'dan tanıdığı diğer Kübalı sürgünlerle arkadaşlığını tazeledi. Haziran'da López onu Raúl Castro ile tanıştırdı. Birkaç hafta sonra Küba'daki siyasi hapishaneden salıverilen Fidel Castro Meksika'ya geldi ve 8 Temmuz 1955'te Raúl, Guevara'yı Fidel Castro ile tanıştırdı. Bütün gece süren ateşli bir sohbetin ardından Guevara, Castro'nun, aradığı esin kaynağı devrim lideri olduğuna kanaat getirerek, Küba diktatörü Fulgencio Batista'yı devirmek için kurulan "26 Temmuz Hareketi''ne katıldı.

Grubun doktoru olmasına karar verildiyse de hareketin diğer üyeleriyle askerî eğitime katıldı, eğitimin sonunda eğitmenleri Albay Alberto Bayo tarafından en göze çarpan öğrenci olarak nitelendirildi. Bu sırada Gadea, Guatemala'dan gelmişti ve Guevara ile ilişkileri devam ediyordu. 1955 yazında hamile olduğunu söyleyince, Guevara hemen evlenmelerini önerdi. 18 Ağustos 1955'te evlendiler ve Hilda Beatriz adını verdikleri kızları 15 Şubat 1956'da doğdu.

25 Kasım 1956'da Tuxpan, Veracruz'dan Küba'ya doğru yola çıkan Granma yatında Kübalı olmayan tek kişi Guevara'ydı. Karaya çıkar çıkmaz Batista'nın askerlerinin saldırısına uğrayan ekibin yarısı hemen orada veya yakalandıktan sonra öldürüldü. Guevara, bu çatışmada kaçan bir yoldaşın düşürdüğü cephaneyi almak için tıbbî malzeme çantasını bıraktığını ve o ânı doktordan savaşçıya dönüştüğü an olarak hatırladığını yazar. Hayatta kalan 15-20 isyancı kaçarak Sierra Maestra dağlarına saklanır ve Batista rejimine karşı gerilla savaşına girişir.

Yoldaşları tarafından cesareti ve askerî yeteneği nedeniyle saygı gören Guevara, isyancılar arasında bir lider, bir Comandante  olur. Birçokları tarafından da "acımasızlığı" nedeniyle korkulur. Muhbir, kaçak ve casus olarak suçlu bulunan birçok kişinin infazından sorumludur. 1958 Aralığının son günlerinde devrimin en önemli olaylarından olan Santa Clara'ya saldıran "intihar timi"ni (isyan ordusundaki en tehlikeli işleri bu tim yapıyordu) yönetti. Generallerinin ve özellikle de General Cantillo'nun "Central America'' isimli çalışmayan şeker fabrikasında Castro ile buluştuğunu ve isyan lideri ile ayrı bir barış pazarlığı yaptığını öğrenen Batista, 1 Ocak 1959'da Dominik Cumhuriyeti'ne kaçmıştır.

7 Şubat 1959'da zafer kazanan hükümet tarafından Guevara, "doğuştan Küba vatandaşı'' ilan edildi. Kısa süre sonra Meksika'dan Granma yatıyla yola çıkmadan önce, ayrıldığı Gadea ile evliliğini resmen sona erdirmek için boşanma işlemlerine başladı. 2 Haziran 1959'da 26 Temmuz Hareketi'nin Küba doğumlu bir üyesi olan ve 1958 sonlarından beri birlikte yaşadığı Aleida March ile evlendi.

La Cabaña Fortress hapishanesinin komutanlığına atandı  ve 2 Ocak 1959'dan 12 Haziran 1959'a kadar altı ay boyunca üstlendiği bu görevdeyken Batista rejiminin memurlarının, BRAC gizli servis (Buró de Represión de Actividades Comunistas, "Komünist eylemlerin bastırılmasından sorumlu servis") mensuplarının, savaş suçlusu olduğu iddia edilenlerin ve siyasî muhaliflerin yargılanması ve infazından sorumlu oldu. TIME dergisine göre yönettiği yargılamaların "adil" olmadığı iddia edilmekteydi.

Daha sonra Ulusal Toprak Reformu Enstitüsü'nde önemli bir göreve geldi  ve Küba Merkez Bankası'nın başkanı oldu.  (Sık sık parayı kınadığı ve yürürlükten kaldırılmasını desteklediği için bu horgörüyü göstermek adına Küba paralarını takma adı olan "Che" ile imzalamıştır).

Bu sıralarda satranca olan ilgisi tekrar canlanan Guevara, Küba'da yapılan ulusal ve uluslararası turnuvalara katılmıştır. Özellikle genç Kübalıları oyunu öğrenmeleri için teşvik ediyor ve onların ilgisini çekecek etkinlikler düzenliyordu.

1959 yılından itibaren Guevara, Küba'dan, diğer ülkelerdeki devrimci hareketlere yardım etti ama bunların tümü başarısızlıkla sonuçlandı. İlk deneme Panama'da yapılmıştı, diğer bir eylem de 14 Haziran'da Dominik Cumhuriyeti'nde yapıldı. ("El Argelino" diye de bilinen Henry Fuerte  ve Enrique Jiménez Moya önderliğinde.)

1960 yılında Guevara, "La Coubre'' silah gemisi patlamasında kurbanlara yardım etti. Kurtarma operasyonu sırasında olan ikinci patlamayla birlikte ölü sayısı yüzü aşmıştır. Bu patlamada ölenlerin cenaze töreninde Alberto Korda, Che'nin ünlü fotoğrafını çekmiştir. La Coubre'nin sabotaj ya da kaza sonucu mu patladığı bilinmemektedir. Sabotaj olduğunu iddia edenler, sorumlu olarak Amerikan Merkezî Haberalma Örgütü CIA'yı gösterirler ve sabotajı yapan kişi olarak da merkezî eyaletlerdeki Batista karşıtı güçlerden Guevara'nın rakibi olan ve daha sonra CIA ajanı olduğu sanılan William Alexander Morgan gösterilir. Kübalı sürgünler, patlamanın sorumlusunun Guevara'nın SSCB'ye sadık rakipleri olduğunu ileri sürerler.

Guevara, daha sonra Sanayi Bakanı  olarak Küba sosyalizminin açık ve kesin bir hale gelmesine yardımcı olmuş, ülkenin önde gelen kişileri arasına girmiştir. "Gerilla Savaşı'' adlı kitabında silahlı başkaldırıya önayak olacak geniş örgütlere gerek duymadan küçük bir gerilla grubu ("foco'') tarafından başlatılan Küba modeli devrim fikrinin tekrar edilmesini savunmuştur. El socialismo y el hombre en Cuba (1965) (Küba'da sosyalizm ve insan) adlı denemesinde sosyalist devletle birlikte "yeni bir insan" biçimlendirmenin gerekliliğini savunur. Bazıları Guevara'yı bu "yeni insan''ın alımlı ve yalın bir modeli olarak görür.

1961 yılındaki Domuzlar Körfezi İşgali'nde Guevara çarpışmalara katılmamıştır. Castro'nun emriyle Küba'nın en batısındaki Pinar del Rio eyaletindeki bir kuvvetin başına geçmiş ve burada sahte çıkarma kuvvetini püskürtmüştür. Bu harekât sırasında yüzünden kurşun yarası almış ama kendi silahının kazara ateş almasıyla yaralandığını söylemiştir.

Guevara, 1962 Ekim ayında ortaya çıkan Küba Füze Krizi'ne neden olan Sovyet nükleer balistik füzelerinin Küba'ya getirilmesinde anahtar rol almıştır. Birkaç ay sonra İngiliz gazetesi "Daily Worker'' ile yaptığı görüşmede eğer füzeler Küba kontrolünde olsaydı başlıca ABD şehirlerine doğru bu füzeleri kullanacağını söylemiştir.